作者：陳金枝*、江芬蘭

摘要：

Cymbidium ringspot virus (CymRSV) 為國外已有發生之病毒，目前國內尚未有此病毒之發生紀錄。本研究針對此病毒進行其核酸及血清檢測試劑製備，以應用於蘭花病毒監測。核酸檢測法方面，以對應CymRSV 鞘蛋白 (coat protein; CP) 之核苷酸序列設計2 組引子對，應用於反轉錄-聚合酶鏈鎖反應法 (reverse transcription-polymerase chain reaction; RT-PCR)。CyRcpu/CyRcpd 引子對可增幅出涵蓋CymRSV-CP 基因全長及其兩端序列共約1370 bp 之片段，CyRu/CyRd 引子對可增幅出CymRSV-CP 基因高保留區約540 bp 之片段，於RT-PCR 中均可成功檢測到市售之CymRSV RNA 標準對照品 (DSMZ 出品)，獲得與預估分子量相符之核酸增幅產物。CyRu/CyRd 引子對於60℃煉合溫度下，於RT-PCR 法中可專一性檢出CymRSV。另外，針對CymRSV-CP 基因序列設計4 條引子 (CyR-FIP/CyR-BIP/CyR-F3/CyR-B3)，以反轉錄-恆溫環形核酸增幅法(reverse transcription Loop-mediated isothermal amplification; RT-LAMP)，可於65℃恆溫條件下於1 h 反應中成功擴增此病毒核酸分子，並直接以目視法判讀反應結果，可專一性檢出CymRSV 之標準對照品，且有高於RT-PCR 約25 倍之靈敏度。在免疫檢測法方面，以人工基因合成CymRSV 全長度鞘蛋白核酸片段，並構築於pET28b 表現載體，於Escherichia coli (Rosetta) 細菌宿主中進行蛋白表現，獲得分子量約41.8 kDa 之融合性表現蛋白 (BEP189)，且可與2 種國外市售之CymRSV 多元抗體產生正反應；以BEP189 做為抗原所製備出之多元抗體 (CymRSV#189) 於間接式-酵素連結免疫吸附反應 (indirect enzyme-linked immunosorbent assay; indirect ELISA) 及西方墨點法 (western blotting) 反應中，均可與其同源之表現蛋白及國外市售之CymRSV 免疫檢測標準品產生正反應，但不與健康蘭花組織以及9 種其他蘭花病毒產生正反應，自製之多元抗體可成功應用於CymRSV 之專一性免疫檢測與鑑別。本研究首次開發RT-LAMP 法於CymRSV 之核酸快檢以輔助對此病毒之鑑定，並研發可實務應用於蘭花上對CymRSV 監測之RT-PCR 技術，且自製之多元抗體可有效地鑑別CymRSV。

關鍵字：CymRSV、血清檢測、RT-PCR 檢測、反轉錄-恆溫環形核酸增幅法

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